چکیده:

شیرسینه‌ی انسان در زمره‌ی بهترین پشتیبان‌های تغذیه‌ای قرار دارد که رشد صحیح را تضمین کرده و بر وضعیت ایمنی نوزادان تازه متولد شده تاثیرات مهمی را اعمال می‌کند. با این حال، زمانی که امکان تغذیه با شیر مادر وجود ندارد، ناگزیر استفاده از شیر خشک برای نوزادان که حدالامکان به تقلید از شیر مادر و سطوح و انواع مواد مغذی موجود در آن تولید شده است،گزینه‌ی پیش رو خواهد بود. با این وجود، برخی نوزادانی که با شیر خشک تغذیه می‌کنند نسبت به آن آلرژی داده و در مقایسه با نوزادانی که از شیر مادر تغذیه می‌کنند سطح شیوع بالایی از بیماری را نشان می‌دهند. آلرژی می‌تواند به دو دسته‌ی آلرژی غذایی با واسطه‌گری ایمونوگلوبین IgE و آلرژی غذایی بدون واسطه‌گری IgE تقسیم گردد. اغلب نوزادان مبتلا به آلرژی پروتئین موجود در شیر گاو (CMPA) علائمی را قبل از یک ماهگی از خود نشان می‌دهند که اغلب بعد از یک هفته پس از ورود شیر خشک دارای شیر گاو به بدن بروز می‌کند. شیر الاغ در امر تغذیه‌ی نوزادان جایگزین بسیار مناسبی برای تغذیه‌ی کودکان دارای حساسیت CMPA می‌باشد، زیرا ترکیب آن بسیار مشابه به شیر انسان می‌باشد. محتوای کل پروتئینی شیر الاغ پایین بوده (۱.۵-۱.۸ گرم / ۱۰۰ گرم) که بسیار نزدیک به شیر انسان می‌باشد. از طریق آنالیز پروفایل پروتئین شیر الاغ که در این مطالعه انجام پذیرفته است، توجه ویژه‌ای به پروتئین‌های شیر معطوف گردید که از حیث پیشگیری و درمان اختلالات بسیاری در بدن انسان بسیار مفید و ایمن بودند. مشخص گردید که محتوای لاکتوفرین، لاکتو پروکسیداز، و پپتیدهای لیزوزیم با فعالیت آنتی میکروبی، قادر به تحریک رشد روده‌ی نوزادی می‌باشند. شیر الاغ بواسطه‌ی محتوای مشخص شده پایین کازئین و ارزش تغذیه‌ای آن بسیار نزدیک به شیر انسان می‌باشد. کل محتوای پروتئین وی موجود در شیر الاغ بین ۰.۴۹ و ۰.۸۰ گرم /۱۰۰گرم می‌باشد که بسیار نزدیک به ترکیب شیر انسان است (۰.۶۸-۰.۸۳ گرم / ۱۰۰ گرم). در بین پروتئین‌های وی، غلظت متوسط آلفا لاکتالبومین در شیر الاغ ۱.۸ mg/ml می‌باشد. نتایج این بررسی قابلیت استفاده از شیر الاغ در تغذیه‌ی کودکان مبتلا به CMPA را تایید می‌کند.

کلید واژه‌ها: شیر الاغ ، آلرژی به شیر گاو ، بخش‌های پروتئینی شیر

1. مقدمه:

واکنش‌های ناسازگارانه به مواد غذایی در حال حاضر به دو دسته واکنش‌های سمی و غیرسمی تقسیم‌بندی می‌شود. واکنش‌های ناسازگاری غیرسمی به شیر در ابتدا یا به علت عدم تولرانس لاکتوز روی می‌دهد و یا در نتیجه‌ی حساسیت به شیر گاو می‌باشد. عدم تولرانس شیر به علت فقدان وراثتی یک آنزیم خاص یعنی بتا گالاکتو سیداز روی می‌دهد که برای هیدرولیز لاکتوز مورد نیاز می‌باشد. برای عدم تولرانس لاکتوز، مهمترین و رایج‌ترین رویکرد درمانی، قطع مصرف شیر حاوی لاکتوز در رژیم غذایی می‌باشد.

آلرژی به پروتئین موجود در شیر گاو (CMPA) به عنوان یک نوع واکنش ایمونولوژیکی به یک یا چند مورد از پروتئین‌های شیر تعریف می‌شود. طیفی از علائم و نشانه‌ها برای CMPA گزارش شده‌اند. CMPA عامل علائم بالینی در ۵ تا ۱۵ درصد از نوزادان می‌باشد. حال آنکه اغلب برآوردهای به عمل آمده از شیوع CMPA تنها در ۲ تا ۵% متفاوت می‌باشد. سردرگمی‌های مرتبط با شیوع CMPA اغلب به علت تفاوت در جمعیت‌های تحت بررسی و فقدان معیارهای تشخیصی تعریف شده برای CMPA می‌باشد. ارائه‌ی معیارهای دقیق و صحیح تشخیصی به منظور پرهیز از ارائه‌ی یک رژیم غذای غلط به نوزادان بسیار مهم می‌باشد زیرا احتمال شیوع سوء تغذیه در آنها را بالا می‌برد.

شیر گاو از حیث شیوع حساسیت در دسته ی هشت ماده‌ی غذایی آلرژی زا از جمله تخم مرغ، سویا، گندم، بادام زمینی، جوز درختی، ماهی و میگو قرار دارد. شیوع CMPA دارای الگوی سنی متفاوت می‌باشد. CMPA در اوایل دوران کودکی بسیار شایع بوده و احتمال شیوع مکرر آن ۲ تا ۶ درصد می‌باشد که با افزایش سن احتمال شیوع تا ۰.۱% -۰.۵% کاهش می‌یابد. گزارش شده است که نوزادان از آن حیث به شیر گاو حساسیت دارند که شیر معمولاً اولین منبع از آنتی ژن خارجی می‌باشد که در حجم وسیعی توسط نوزادان خورده می‌شود و سیستم روده‌ی انسان قابلیت رشد کافی برای هضم آن نداشته و از لحاظ ایمونولوژیکی نسبت به پروتئین‌های موجود درآن واکنش نشان می‌دهد. زمانی که شیر حذف می‌شود، پاسخ التهابی به آن نیز کنترل می‌شود. بعد از گذشت چند سال تولرانس خوراکی نوزاد رشد کرده و شیر مجدداً توسط این افراد تحمل می‌شود.  اغلب کودکان دارای آلرژی به شیر همچنین دارای واکنش‌های ایمنی نسبت به شیر می‌باشند. در بزرگسالان، CMPA شیوع کمتری در مقایسه با عدم تولرانس لاکتوز دارد. حتی گزارش شده است که تقریبا ۱% از جمعیت افراد بالغ دارای آنتی بادی‌های IgE مخصوص به شیر می‌باشند. با این حال مطالعات انجام شده در رابطه با CMPA در افراد بزرگسال بسیار اندک و معدود می‌باشد. CMPA حتی زمانی می‌تواند روی دهد که کودکان تغذیه کننده با شیر مادر (BF) شروع به تغذیه با شیر خشک گاو (CMF) کنند و معمولاً این آلرژی در همان چند هفته‌ی اول پس از ورود شیر گاو به بدن روی می‌دهد. نشانه‌های این آلرژی اغلب در سطحی از مجرای گوارشی (۵۰ تا ۶۰%)، پوست (۵۰ تا ۶۰%) و مجاری تنفسی (۲۰ تا ۳۰%) مشاهده می‌شود، این نشانه‌ها معمولاً متوسط تا شدید می‌باشند. از لحاظ ایمونولوژیکی CMPA می‌تواند با واسطه‌گری IgE و یا بدون آن روی دهد.

در انسان، شیر گاو در طول دوران شیرخوارگی، متداولترین منبع غذایی به شمار می‌رود، اما این ماده اولین ماده‌ی غذایی آلرژی زا در بدن انسان می‌باشد. در اغلب کشورها، شیر گاو مهمترین ماده‌ی غذایی آلرژی زا در بین شیر خوارگان و کودکان می‌باشد. واکنش‌های ناسازگارانه نسبت به شیر گاو در ۲% از شیرخوارگان در همان سال اول زندگی، یعنی ۳۰% از آن در ۱ ماهگی و ۶۰% از موارد در ماه سوم و ۹۶% نیز در سال اول زندگی روی می‌دهد. علائم حساسیت حتی در طول دوران تغذیه با شیر سینه نیز می‌تواند بروز یابد زیرا نوزادان تازه متولد شده نسبت به حتی مقدار اندک کازئین‌های موجود در شیر مادر از خود واکنش نشان می‌دهند. اغلب کودکان تا سه سالگی درگیر این حساسیت بوده و ۵۶% از موارد حساسیت نسبت به این ماده‌ی آلرژی زا در یک سالگی ،۷۷% در دو سالگی و ۸۷% در سه سالگی برطرف می‌شود. با این حال آلرژی تا آخر عمر آنها می‌تواند وجود داشته باشد. در رابطه با استفاده از منابع جایگزین شیر برای انسان در موارد ابتلا به آلرژی شیر گاو، باید از استفاده از شیر بز نیز اجتناب گردد، زیرا این شیر نیز دارای سطح ریسک بالایی از واکنش‌پذیری می‌باشد. حال آنکه شیر الاغ و مادیان، که در رویه‌ای معمول برای کودکان دارای حساسیت مورد استفاده قرار می‌گیرد، منابع پروتئینی جایگزین و مناسبی می‌باشند که از حیث بهداشتی نیز بسیار مورد بررسی قرار گرفته‌اند. بحث انجام شده در رابطه با استفاده شیر خشک نوزادی با بنیان سویا بسیار دشوار و پیچیده می‌باشد، زیرا جامعه‌ی علمی دارای توصیه‌های متفاوتی در این مورد می‌باشند. اما اتفاق آرا قابل قبولی در مورد اظهارات زیر وجود دارد: شیوع آلرژی به سویای موجود در شیر خشک نوزادان قابل مقایسه با آلرژی ناشی از CMPA در کودکان مصرف کننده‌ی شیر خشک حاوی شیر گاو می‌باشد. واکنش به سویا در ۱۰ تا ۳۵% از نوزادان مبتلا به CMPA گزارش شده است بدون اینکه آنها پاسخ مثبت و یا منفی به IgE اختصاصی نسبت به CMP باشند. در این خصوص، نوزادانی که آلرژی‌های متعددی نسبت به مواد غذایی و انتروکولیت‌های ائزینو فیلی دارند نسبت به پروتئین سویا واکنش نشان می‌دهند، از این رو گروه‌های تخصصی مختلفی نقطه نظرات مختلفی را در استفاده از شیر خشک حاوی سویا در افراد CMPA دارند، اما به طور کلی مصرف آن قبل از ۶ ماهگی توصیه نمی‌شود.

الاغ عضوی از خانواده ی اسبان می‌باشد، این حیوان قرن‌های متمادی است که در کنار انسان و برای انسان کار می‌کند. از متداول‌ترین  نقش این حیوان می‌توان به استفاده از آن در حمل و نقل اشاره کرد. ولی هنوز هم در برخی نواحی فقیرنشین از این حیوان بدین منظور استفاده می‌شود. در مقایسه با شیر نشخوارکنندگان، شیر الاغ در گذشته بسیار کم مورد بررسی قرار گرفته است، اما در سال‌های اخیر محققات توجه ویژه‌ای را به سمت شیر الاغ متمرکز کرده و سرمایه‌ی زیادی را صرف تحقیق در این مورد کرده‌اند. ترکیب پروتئینی این شیر در حد معنا داری متفاوت از شیر گاو می‌‌باشد (جدول ۱). محتوای کل پروتئینی آن (۱.۵-۱.۸ g/100g) بوده و کاملاً مشابه با شیر انسان و مادیان می‌باشد. این شرایط مانع از تحمیل بارسنگین کلیوی این محلول می‌شود. تفاوت مهم بین این دو شیر در نسبت پروتئین وی در آنها می‌باشد. آنها دارای ۳۵ تا ۵۰% بخش نیتروژنی می‌باشند، حال آنکه شیر گاو حاوی ۲۰% نیتروژن می‌باشد. در مقایسه با شیر الاغ و شیر مادیان، کازئین پروتئین وی نسبت به شیر مادیان ۰.۱:۱ بلافاصله پس از زایمان بوده و تا میزان ۱.۲:۱ در طول هفته اول شیردهی تغییر می‌یابد.

2. بخش آزمایشی

نمونه‌های شیری از مزرعه‌ای واقع شده در مرکز ایتالیا، از ۲۰ الاغ پرورش یافته مارتینا فرانکا در مرحله‌ی میانی شیردهی گردآوری گردید. بررسی پروفایل پروتئین شیر الاغ با استفاده از تکنیک مختلف جهت جداسازی پروتئین‌ها انجام پذیرفت، که ابتدا بر مبنای تکنیک‌های کروماتوگرافی بوده و به دنبال آن از روش الکتروفورز ژل پلی اکریلامید سولفات دو دسیل سدیم SDS-PAGE استفاده شد. به دنبال آن شیر از طریق الکتروفورز دو‌بعدی مورد ارزیابی قرار گرفته (۲-DE) و به دنبال آن نیز توالی‌یابی N ترمینال به منظور ارائه ی یک دید پانورامیک دقیق‌تر از پروتئین‌های موجود در شیر الاغ استفاده گردید. سهم کازئین شیر الاغ با استفاده از رویکردهای کروماتوگرافیک و با استفاده از سیستم HPLC خالص ساز Akta : کروماتوگرافی مبادله‌ی یون، و کروماتوگرافی فاز معکوس توسط ردیف فسفری C4 انجام پذیرفت. بعد از انجام کروماتوگرافی هر پروتئین در مواجهه با SDS-PAGE قرار گرفتند. کازئین‌های خالص‌سازی شده با استفاده از توالی‌یابی N ترمینال شناسایی شدند.

3. نتایج و بحث:

با استفاده از کروماتوگرافی مبادله‌ی کاتیون، در PH 5 و ۷، به دنبال آن ۱۵% SDS-PAGE مورد استفاده قرار گرفت، با استفاده از این روش‌ها امکان جداسازی ۹ پیک فراهم گردید که تحت عنوان بتاکازئین، و الفا ۱ کازئین بوده و دارای وزن مولکولی متفاوت بودند. کروماتوگرافی فاز معکوس در (HPLCRP-HPLC) به دنبال SDS-PAGE 15% و تحلیل N ترمینال در شیر الاغ خامه دار انجام گرفته و سه نقطه‌ی پیک نیز به عنوان لیزوزیم (توالی KVFSKXELA)، آلفا لاکتالبومین (توالی KQFTKXELSQVLXSM) و بتا لاکتا گلوبولین (توالی TINPQTMQ) به‌ترتیب شناسایی شدند. RP-HPLC نیز در جز کازئین شیر الاغ و بعد از ته نشست آن در شیر خامه گرفته شده در PH 4.6 انجام پذیرفت. پنج نقطه‌ی پیک از هر کدام از تحلیل‌های N ترمینال و SDS-PAGE برابر ۱۳% به دست آمده و نتایج در جدول شماره ۲ ارائه گردید که غالباً اشاره به وجود α_S1 –کازئین و بتا کازئین‌ها دارد.

این بررسی‌ها  وجود بتا کازئین‌ها و آلفا کازئین‌ها را در شیر الاغ نشان داد که دارای همخوانی معناداری با کازئین‌های as_۱– و بتا کازئین‌های شیر مادیان می‌باشد. این نتایج شباهت بالایی را نیز بین شیر الاغ و انسان نشان می‌دهند. در واقع وجود αs_۲– کازئین در شیر انسان در این بررسی مشخص نشد.

به منظور نیل به نتایج بهتر جداسازی بخش‌های کامل کازئین موجود در شیر الاغ، ما تحلیل ۲–DE در رنج PH 4-7 برای بعد اول انجام داده و در ۱۳% SDS-PAGE را برای بعد دوم به انجام رساندیم. در نتیجه، حدود ۱۴ نقطه یا تعداد بیشتری نقطه با جرم مولکولی متفاوت از ۲۷.۲۴ تا ۳۳.۷۴ kDa و مقادیر PI متفاوت از ۴.۶۳ تا ۵.۳۶ مشاهده گردید. نقشه‌ی ۲-DE یک چشم انداز پانورامیک در مورد ترکیب پروتئینی شیر الاغ نشان می‌دهد، در بین کازئین‌های موجود در شیر الاغ، بتا کازئین‌ها (نقطه‌های A-H) و α_S1– کازئین‌ها (نقطه‌های I-N) غالب بوده  و ناهمخوانی قابل توجهی نیز به علت درجات متفاوت فسفریلاسیون و وجود واریانت های ژنتیکی مشاهده گردید.

به لصف آنالیز RO-HPLC امکان محاسبه‌ی غلظت‌های لیزوزیم، بتا لاکتوگلوبولین و آلفا لاکتالبومین (برحسب میلی‌گرم / میلی‌لیتر) در مراحل مختلف شیر دهی (۶۰،۹۰،۱۲۰،۱۶۰ و ۱۹۰ روز پس از زایمان) فراهم گردید و نتایج در جدول شماره‌ی ۳ ارائه گردید.

میزان لیزوزیم موجود در شیر الاغ در طول مراحل مختلف شیردهی متفاوت بوده و دارای میانگین ۱.۰ میلی‌گرم / میلی‌لیتر می‌باشند که در سطح بالاتری در مقایسه با وجود این ماده در شیر گاو ، انسان (۰.۱۲ میلی‌گرم / میلی‌لیتر) و شیر بز می‌باشد، حال آنکه این میزان بسیار نزدیک به شیر مادیان می‌باشد ( ۰.۷۹ میلی‌گرم / میلی‌لیتر) می باشد .میانگین محتوای بتا لاکتو گلوبولین در شیر الاغ (۳.۷۵ میلی‌گرم / میلی‌لیتر) بسیار نزدیک به شیر گاو ( ۳.۳ میلی‌گرم / میلی‌لیتر) و شیر مادیان (۳.۰ میلی‌گرم / میلی‌لیتر) می‌باشد، حال آنکه این ماده در شیر انسان وجود ندارد. محتوای آلفا لاکتولبومین در شیر انسان (۱.۶ میلی‌گرم / میلی‌لیتر) می‌باشد که کمتر از محتوای این ماده در شیر مادیان می باشد (۳.۳ میلی‌گرم / میلی‌لیتر).

لاکتوفرین نیز با استفاده از روش کروماتوگرافی مبادله‌ی کاتیونی (Mono S HR 5/5 ردیف، GE) خالص‌سازی شده و هویت آن نیز از طریق توالی یابی N ترمینال و تحلیل وسترن بلات و با استفاده از آنتی‌بادی‌های آنتی – لاکتو فرین تایید گردید. تعیین و تشخیص کیفی لاکتوفرین شیر الاغ نتیجه‌ی ۰.۰۸۰±۰.۰۰۳۵  g/L را نشان می دهد  که مشابه با مورد موجود در شیر مایدیان (۰.۱ g/L)، گاو (۰.۰۲ -۰.۲ g/L) و بز (۰.۰۶-۰.۴۰ g/l) و شیر گوسفند (۰.۱۳۵g/L می‌باشد)، اما در مقایسه با محتوای لاکتوفرین در شیر انسان این مقدار کمتر می‌باشد که رقم آن تقریباً معادل ۱.۰-۶.۰  g/L می‌باشد.

لاکتوپروکسیداز یک گلیکو پروتئین متشکل از زنجیره‌ی پپتید واحد با وزن مولکولی ۷۸.۰ kDa می‌باشد. این آنزیم از طریق اکسیداسیون یون‌های تیوکاینات (SCN-) توسط پروکسیدهیدروژن عملکرد آنتی میکروبی خود را ایفا می‌کند، که هم در اغلب مایعات بیولوژیکی و هم در شیر یافت می‌شود. فعالیت لاکتو پروکسیداز در شیر خامه گرفته شده الاغ از طریق تشخیص سرعت مدام طیفی‌سنجی نور و با استفاده از سوبستراهای ۲.۲ پریم آزینوبیس (۳ اتیل بنزتیازولین -۶ سولفوریک اسید) مشخص گردید. در شیر الاغ فعالیت لاکتو پروکگسیداز بسیار پایین بود. ۴.۸۳±۰.۳۵ Mu/m. کمیت‌سنجی آنزریمی نیز از طریق یک لاین کالیبراسیون به دست آمده بواسطه‌ی نقطه گذاری نانو گرام‌های محلول ‌ای استاندارد پروکسیداز علیه فعالیت آنزیمی حاصل شد. غلظت میانه (±SD) لاکتو پروکسیداز شیر الاغ طبق محاسبه ۰.۱۱±۰.۰۲۷ می‌باشد که بسیار نزدیک به مقدار موجود در شیر انسان (۰.۷۷±۰.۳۸ میلی گرم / لیتر) در مقایسه با شیر گاو می‌باشد. در جدول شماره ی ۴ غلظت این سه پروتئین و تاثیر آنتی میکروبی آنها در مقایسه با شیر الاغ انسان و گاو ارائه شده است. با توجه به این داده‌ها می توان دریافت که شیر انسان و الاغ دارای مقادیر قابل توجهی لیزوزوم و لاکتو فرین می‌باشند، اما لاکتوپروکسیداز موجود بسیار اندک می‌باشد.

4. نتیجه‌گیری

شواهد بالینی اخیر توجه ویژه به شیر الاغ را با توجه به تولرانس بالایی که در نوزادان مبتلا به آلرژی شیر گاو دارد، تجدید کرده است. به عنوان یک جایگزین مناسب برای کودکان محروم از شیر مادر، شیر الاغ قادر به ایفای بسیاری از عملکردهای آنتی باکتریال مشترک با شیر انسان می‌باشد. کازئین‌های موجود که اغلب از نوع αs1- کازئین و بتا کازئین‌ها بودند، همخوانی قابل توجهی را از خود نشان دادند. محتوای بالای لیزوزیم و آلفا لاکتولبومین در شیر الاغ به عنوان عامل آنتی میکروبی و ضدباکتری در شیر الاغ یافت شده است که مسئول تعداد اندک محتوای باکتریایی گزارش شده در این مقاله می‌باشد. لیزوزیم، لاکتو پروکسیداز، و لاکتو فرین نیز به عنوان عوامل آنتی میکروبی و باکتریواستاتیک شناسایی شده‌اند که نقش مهمی را در پیشگیری از بروز عفونت‌های روده‌ای در نوزادان ایفا می‌کنند. عملکرد آنها زمانی به حداکثر خود می‌رسد که در نگهداری بهداشتی شیر الاغ و پتانسیل نسبی آن در عرضه‌ی تجاری شیر الاغ تجدید نظر صورت پذیرد. شیر الاغ محتوای لیزوزومی بالایی از خود نشان می‌دهد و در عین‌حال لاکتو پروکسیداز موجود در آن بسیار اندک می‌باشد. بر اساس نتایج به دست آمده از بررسی‌های شیر الاغ مشخص گردید که این شیر گزینه‌ی جایگزین مناسبی برای تغذیه‌ی نوزادان محروم از شیر مادر می‌باشد زیرا ترکیب شیمیایی آن و بویژه محتوای پروتئینی آن بسیار مشابه شیر انسان است. امروزه باید توجه بیشتری به مشخصات بهداشتی در تولید شیر الاغ صورت گیرد تا این شیر تبدیل به منبع جایگزین پروتئین‌های هیدرولیز شده و یا شیر خشک حاوی سویا در درمان نوزادان مبتلا به آلرژی شیر گاو گردد.